紫外可見分光光度計高分子結合物含量測定法

本法系利用高分子結合物、低分子結合物及游離多糖

在不同乙醇濃度下，沉淀分離，采用紫外-可見分光光度

法測定磷含量，計算高分子結合物的含暈。‘

試劑 （1) 5mol/L氯化鈉溶液精密稱定氯化鈉

29.22g，加水溶解并稀釋至100ml，室溫保存。

(2) 1.5mol/L硫酸于1體積9 8 %的硫酸中加入11

體積的水，混勻。

(3) 2. 5 % 鉬酸銨稱取鉬酸銨2.65g，加水溶解并

稀釋至100ml。

(4) 1 0 %抗壞血酸稱取抗壞血酸10g，加水溶解并

稀釋至100ml。

( 5 )礦化試劑硫酸與7 0 %髙氯酸等體積混合制得。

( 6 )產色試劑水、1.5mol/L硫酸、2. 5 % 鉬酸銨、

1 0 %抗壞血酸，按2 : 1 : 1 : 1體積比混合配制。

(7) 80Mg/ml磷對照品貯備液精密稱定經100°C干燥

的磷酸氫二鈉0. 3665g或磷酸二氫鉀0. 3509g,加水500ml、

5mol/L硫酸溶液10ml溶解，補加水至1000ml。臨用時，

將貯備液做20倍稀釋，即為4Mg/ml磷對照品工作液。

(8) l.Otnol/L氫氧化鈉溶液稱取4 g氫氧化鈉，加

水溶解并稀釋至100ml。

供試品溶液的制備 （1) 分步沉淀原液用生理氯

化鈉溶液稀釋至多糖含量20?2 % g / m l或成品疫苗3ml,

加人5mol/L氯化鈉溶液0.75ml，混勻后加人無水乙醇

1 5 m l ,于一20°C冰箱放置72?96小時，以每分鐘8000轉

4°C離心9 0分鐘，吸取上清液為供試品溶液2 ; 于沉淀中

加人50,%乙醇溶液0.5ml，加玻璃珠，混合后室溫放置1

小時；再加人5 0 %乙醇溶液1.5ml，混合后室溫放置2 小

時然后以每分鐘8000轉8°C離心1小時，吸取1.8ml上

清液為供試品溶液3 ; 沉淀再加人l.Omol/L氫氧化鈉溶

液0.5ml，混合后室溫放置1小時，加水1.25ml，作為供

試品溶液4。

( 2 )取多糖含量20?的原液或成品疫苗

1.0ml為供試品1。

( 3 )供試品溶液的礦化分別量取1.0ml供試品1、

1.5ml供試品溶液2、0.7ml供試品溶液3、0.5ml供試品

溶液4 各2 份；分別加人礦化試劑0. 15ml，置150°C干燥

1小時，然后升溫至180°C干燥3 0分鐘，再升溫至250°C

干燥1小時。

測定法量取水1.95ml，加礦化試劑50卩1后加

2.0ml產色試劑，混勻后置37°C水浴2 小時，在波長

82 5 m n處測定吸光度，作為空白對照。

于礦化好的供試品溶液中加水1.85ml，加產色試劑

2.0ml,混勻后置37°C水浴2 小時，在波長8 2 5 n m處測定

吸光度。

分別量取磷對照品工作液0.1ml、0.2ml、0.4ml、

0.8ml、1.0ml于試管中，每管依次加水1. 85ml、1.75ml、

1.55ml、1.15ml、0.95ml；然后每管分別加人礦化試劑

50M1后加2.0ml產色試劑，混勻后置37°C水浴1 小時，

在波長82 5 n m處測定吸光度。

結果計算以憐對照品溶液的濃度對其相應的吸光度

作直線回歸，求得直線回歸方程。將供試品溶液的吸光度

代人直線回歸方程，求出磷含量。

供試品磷含量（y g/ml)分別為：

p^CA.xsy/i.o

P 2 = (A2X18. 75)/1.5

P 3- ( A 3X2.0)/0. 7

P 4 = ( A 4 X2. 0)/0. 5-(P3X10)/100

試驗有效性 8 0 % < _ P 1A P 2+ P 3+ 尺）< 1 2 0 %

供試品高分子結合物含量（％) = 巧/(朽+ P 3+ h ) X

100

供試品游離多糖含量（％)=[1 — P 4/(朽+ P 3+ P 4 ) ] X

100

式中P ,、P 2、P 3、尸4 為供試品1，供試品溶液2，

供試品溶液3，供試品溶液4 的磷含量；A ,、A 2、A 3、

八4為供試品1，供試品2，供試品3，供試品4 中取樣礦

化后的磷含量。