紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)法測(cè)定核酸核苷酸的原理

核酸、核苷酸及其衍生物的分子結(jié)構(gòu)中的嘌呤、嘧啶堿基具有共軛雙健 系統(tǒng)（－C＝C 一C＝C 一），能夠強(qiáng)烈吸收250~280nm 波長(zhǎng)的紫外光。核 酸（DNA，RNA）的zui大紫外吸收值在260nm 處。遵照Lambert-Beer 定律， 可以從紫外光吸收值的變化來(lái)測(cè)定核酸物質(zhì)的含量。在不同pH 溶液中嘌呤、 嘧啶堿基互變異構(gòu)的情況不同，紫外吸收光也隨之表現(xiàn)出明顯的差異，它們 的摩爾消光系數(shù)也隨之不同。所以，在測(cè)定核酸物質(zhì)時(shí)均應(yīng)在固定的pH 溶 液中進(jìn)行。
核酸的摩爾消光系數(shù)（或吸收系數(shù)），通常以ε（ρ）來(lái)表示，即每升含 有一摩爾核酸磷的溶液在260nm 波長(zhǎng)處的消光值（即光密度，或稱(chēng)為光吸 收）。核酸的摩爾消光系數(shù)不是一個(gè)常數(shù)，而是依賴(lài)于材料的前處理、溶液 的pH 和離子強(qiáng)度發(fā)生變化。它們的經(jīng)典數(shù)值（pH = 7.0）如下：
DNA 的ε（ρ）= 6 000 － 8 000
RNA 的ε（ρ）= 7 000 －10 000
含1μg /mL RNA 溶液的光密度為0.022~0.024。采用紫外分光光度法測(cè) 定核酸含量時(shí)，通常規(guī)定：在260nm 波長(zhǎng)下，濃度為1μg/mL 的DNA 溶液 其光密度為0.020，而濃度為1μg/mL 的RNA 溶液其光密度為0.024。因此， 測(cè)定未知濃度的DNA（RNA）溶液的光密度OD260nm，即可計(jì)算測(cè)出其中 核酸的含量。
該法簡(jiǎn)單、快速、靈敏度高，如核酸3μg／mL 的含量即可測(cè)出。對(duì)于 含有微量蛋白質(zhì)和核苷酸等吸收紫外光物質(zhì)的核酸樣品，測(cè)定誤差較小，若 樣品內(nèi)混雜有大量的上述吸收紫外光物質(zhì)，測(cè)定誤差較大，應(yīng)設(shè)法事先除去。
三、器材
1、分析天平；2、離心機(jī)； 3、容量瓶；4、紫外分光光度計(jì)；5、吸管
6、冰浴或冰箱
四、試劑
1、5%~6%氨水
2、鉬酸銨-高氯酸試劑（沉淀劑）。如配制200mL 可在193mL 蒸餾水中加
入7mL70%高氯酸和0.5g 鉬酸銨。
五、操作
1、用分析天平準(zhǔn)確稱(chēng)取待測(cè)的核酸樣品500 mg，加少量蒸餾水調(diào)成 糊狀，再加入少量的水稀釋。然后用5%~6%氨水調(diào)至pH7，定容到50mL。
2、取2 支離心管，向*支管內(nèi)加入2mL 樣品溶液和2mL 蒸餾水； 向第二支管內(nèi)加入2mL 樣品溶液和2mL 沉淀劑，以除去大分子核酸作為對(duì)照。 混勻。在冰浴或冰箱中放置30 分鐘后離心（3000r/min，10 分鐘）。從* 管和第二管中分別吸取0.5mL 上清液，用蒸餾水定容到50mL。用光程為1cm 的石英比色杯，于260nm 波長(zhǎng)處測(cè)其光吸收值（A1 和A2）。
六、計(jì)算
如果已知待測(cè)的核酸樣品不含酸溶性核苷酸或可透析的低聚多核苷酸， 即可將樣品配制成一定濃度的溶液（20~50kg/mL）在紫外分光光度計(jì)上直接 測(cè)定。