紫外可見分光光度計測酶活性原理及過程

紫外可見分光光度計是利用物質對光的選擇性吸收或發射的現象，通過測量不同波長的光能 量變化（當入射光強度一定時，介質的吸光度于介質中吸光物質和介質濃度的乘積成正比） 而對物質進行定性和定量分析的儀器。被廣泛用于水質，大氣，降雨，土壤，工業生產，藥

品檢驗，污水檢驗，香料，醫藥，疾控，人體化指標分析，化妝品，金屬元素，無機鹽，海

洋地質勘察，水廠，污水處理，農藥殘留，作物成分，化肥檢測，土壤成分，植物保護，植

物檢疫，飼料檢測，動物疾病預防，防腐劑等。

在食品行業中酶制劑是很好的保鮮添加劑，需要通過加熱等方法消除其不利影響。而紫外-可見分光光度法是研究酶性質的重要方法之一,這次實驗儀器使用的是UV1901PC雙光束紫外可見分光光度計，產地上海，品牌奧析，生產廠家為光源燈使用全進口光源，氘燈為濱松無臭氧環保型氘燈，可以減少操作者對臭氧的吸入（長期吸入臭氧對人體有害），鎢燈為德國歐士朗鎢燈，檢測器為美國派來茲，并且使用加厚光學底板，更加保證了儀器的穩定性。

儀器的光度系統分成兩條光路，一條測試光路，一條參比光路。在參比窗口上放置一參照物；測試窗口則先后放置參比標準和待測樣品。

參比光路和參照物的作用是，監測參比標準和待測樣品測量過程中光源能量波動和電氣部分的漂移，計算機將兩次測量中的變化情況逐個記錄，在zui后計算時予以校正，因此雙光束紫外可見分光光度計的讀數值的準確性更高。

操作步驟

在25℃ 4.5ml 50mmol/L pH8.3的K2HPO4- KH2PO4緩沖液中加入待測SOD樣液，再加入 10ul 50mmol/L的連苯三酚，迅速搖勻，倒人光徑lcm 的比色杯，在UV1901PC雙光束紫外可見分光光度計325nm波長下每隔30s測一次A值。同時測定SOD標準品，對所測樣品SOD活性進行校正。在lml反應液中，每分鐘抑制連苯三酚自氧化速率達50%時的酶量為一個酶活單位， 即325nm 0.035OD/min為一個酶活單位，此種方法測超氧化物歧化酶。

0.1mL酶液與lmL 0.1 mol/L鄰苯二酚（用pH 8.4檸檬酸-磷酸緩沖液配制）80oC反應3min，用2mL 20%TCA終止反應，于波長450nm處用UV1901PC雙光束紫外可見分光光度計測定吸收值。上述條件下，將每分鐘OD值增加0.01定義為1個酶活力單位，此種方法測多酚氧化酶

向具塞試管中加入1.8mL 0.30% 聚半乳糖醛酸溶液（用0.05 mol/L Na2CO3/NaHCO3緩沖溶液配制，調節pH 10.0），于55℃水浴下保溫5 min，然后加入一定稀釋倍數的酶液0.2 mL反應15 min，加入DNS試劑1.5 mL，混勻，在沸水中加熱10min，立即用自來水冷卻，再加入21.5 mL蒸餾水，混勻，于UV1901PC雙光束紫外可見分光光度計上520 nm測定吸光度。空白用煮沸失活的酶液代替。在上述試驗條件下，以每分鐘分解底物產生1μmol半乳糖醛酸所需的酶量為1個酶活力單位，此種方法測果膠酶。

用移液管將0.5 mL酶溶液移入試管，并在水浴中調溫至25℃。加0.5 mL已同樣預熱到25℃的1%淀粉溶液。3 min后加1.0 mL DNS顯色劑。置試管于沸水中5 min，冷卻后用10 mL蒸餾水稀釋。用UV1901PC雙光束紫外可見分光光度計于540 nm處以空白作對照測定吸光度。以0.5 mL磷酸鹽緩沖液代替酶液測定空白值。植酸酶以植酸鈉為底物，采用釩鉬酸銨法測定植酸酶的酶活。吸取1 mmol/l的植酸鈉（酶作用底物，用0.25 mol/l、pH值5.50醋酸-醋酸鈉緩沖液配制）1.0 ml，37 oC預熱5 min后，準確加入適當稀釋的酶液0.5 ml（對照組先加反應終止液），37 oC水浴反應30min后，再加入4 ml反應終止液（現用現配）冷卻至室溫，在415 nm處測定OD值，利用無機磷標準曲線計算出酶活。在37℃，每分鐘從1 mmol/l植酸鈉溶液中（用pH值5.5的醋酸-醋酸鈉緩沖液配制）釋放出1 nmol無機磷所需要的酶量為一個酶活單位，此種方法測胰α-淀粉酶

在0.5mL適當稀釋的酶液中加入質量分數為0.625%的羧甲基纖維素鈉溶液 ，于50℃水浴中保溫30min，加2.0 mL質量分數為10%的NaOH溶液終止反應，再加入2.5mLDNS試劑，于沸水浴中煮沸15min，冷卻，在UV1901PC雙光束紫外可見分光光度計550 nm波長處比色，要求光密度讀數盡可能在標準曲線的0. 5 mg葡萄糖處。每次測定均設立空白對照，對照管先加入0.5mL酶液，然后加入2. 0 mL質量分數為10%的NaOH溶液將酶滅活，再依次加入質量分數為0.625%的底物2. 0 mL，與待測管一起保溫，加入DNS，煮沸、冷卻、稀釋比色、與標準曲線對照。在上述條件下，每30min產生0.5mg還原糖為1個Cx活力單位，即每1 h產生1.0mg還原糖為1個Cx活力單位，此種方法測羧甲基纖維素酶。

  以木聚糖為底物，用DNS法測定還原糖的生成量。取稀釋酶液0.1ml，加 1%木聚糖液0.9ml，置50℃水浴保溫30min后，加DNS 2ml于沸水浴中顯色3min，用自來水冷卻后，加蒸餾水定容25ml，測O.D值，此種方法測木聚糖酶。每毫升酶液每分鐘水解木聚糖生成1μmol木糖所相當的酶量。

中性蛋白酶在一定的溫度和pH條件下，水解酪素底物產生含有酚基的氨基 酸，在堿性條件下，將福林試劑還原，生成鉬藍與鎢藍，其顏色深淺與酚基氨基酸含量成正 比。通過在660 nm測定其吸光度，可得到酶解產生的酚基氨基酸的量，計算出蛋白酶活力， 以此代表蛋白酶的總酶活力。取3支試管（一支空白管，兩支樣品管），分別向3支試管中準確加入稀釋好的待測酶液1.0 mL，將3支試管放入40℃水浴中預熱5 min，同時將測定底物（1%酪素）置同一溫度水浴中預熱5 min。分別向兩只樣品管中加入1%酪素溶液1.0 mL，準確計時，反應10 min取出。迅速準確向兩只樣品管加入0.4 mol/L三乙酸2mL，于空白管中加入0.4 mol/L三乙酸2 mL和1.0 mL 1%酪素溶液，搖勻。3支試管中反應液用濾紙過濾。另取3支試管，分別吸取上述相應濾出液1.0 mL，0.4 mol/L碳酸鈉溶液5.0 mL和稀福林試劑1.0 mL，搖勻，置40℃水浴中放置20 min（顯色），取出，迅速冷卻置室溫。，在紫外可見分光光度計波長660 nm處分別測兩支樣品管吸光度，取平均值。通過查標準曲線求出生成酪氨酸的含量。

　α-淀粉酶在10 mL 試管中依次加入0. 5%可溶性淀粉溶液1 mL ， pH 4. 2的磷酸氫二鈉-檸檬酸緩沖液2. 5 mL， 40 ℃預熱10 min。然后加入多倍稀釋的0. 5 mL 酶液， 40 ℃保溫5 min后，加入0. 1 mol/L H2 SO4 1 mL 終止反應。再取2 mL 反應液與0. 5% KI - I2 溶液0. 5 mL顯色，測定OD620。與淀粉梯度標準曲線對照得反應液淀粉濃度后，計算酶活力。在pH 4. 2、溫度40 ℃下， 5 min水解可溶性淀粉1 mg所需的酶量為一個酶活力單位 。