UV1901PC紫外可見分光光度計測二羥基丙酮含量

二羥基丙酮(1,3-dihydroxyaceton，簡稱DHA，1)是一種天然存在的酮糖，具有生物可降解性，對人體和環境無毒害，可食用。1是一種重要的醫藥中間體，也可作為一種抗病毒試劑 [1]。1能與皮膚zui上層物質（如角質層內的氨基酸）發生Maillard反應使皮膚達到棕色到深色的染色效果。根據這一原理1在臨床上被廣泛應用于治療白癲風[2]，它也被用來做為混合型卟啉病的保護劑[3]。還有研究表明在紫外照射下1能延緩皮膚癌變[4]。

1的生產方法主要有微生物發酵法和化學合成法，國外比較成熟的工業生產主要是用含有甘油脫氫酶的微生物以甘油底物發酵生產。目前，發酵液中1檢測方法有氣相色譜法[5]、液相色譜法[6]、薄層層析法[7]。氣相色譜法測定時1不能直接汽化，需要進行衍生化，操作繁瑣；液相也比較耗時。薄層層析法只能定性分析，無法定量。在酸性溶液中1的酮基與二苯胺（diphenylamine，2）的氨基發生反應生成藍色復合物，在608 nm處吸光度與1的濃度呈線性關系，在酸性條件下，2不與甘油發生反應。

圖1 2分光光度法反應原理

1  儀器與試劑

UV1901PC型紫外可見光分光光度計（上海奧析科學儀器有限公司）

1（Bio Basic公司）；2（上海試劑三廠）；無水乙酸；濃硫酸；甘油；酵母粉；磷酸二氫鉀。

菌種：葡糖桿菌Gluconobacter sp. HD 410，由河南大學生物工程研究所篩選并保藏。發酵培養基成分：甘油10%，酵母粉1.5%，無水KH2PO4­ 0.5%，pH自然。

2  方法與結果

2.1 溶液配制

1溶液：準確稱取1 1 g，于1000 ml容量瓶中定容，制成1 g/l 母液，分別加蒸餾水配制成0、0.1、0.15、0.2、0.25、0.3、0.35、0.4、0.45、0.5 g/l的1梯度溶液。

2溶液：準確稱取2 0.6 g，量取無水乙酸54 ml邊攪拌邊加入濃硫酸 6 ml，混勻后加入稱取的2，至*溶解后密封保存。

2.2  2分光光度法測定1

標準曲線繪制：分別取0.5 ml 1梯度溶液，4.5 ml 2溶液，于比色管中沸水浴14 min，流水冷卻。以不含1的溶液為空白參比，UV1901PC紫外可見分光光度計608 nm處測樣品的吸光值。每個樣品三次重復，取平均值。

2.3發酵液1含量測定：取對數期種子液，按5%的接種量接入搖瓶。200 r/min，28°C發酵3~4 d，取發酵液1.5 ml，8000 g離心10 min。取上清液0.5 ml用蒸餾水稀釋100倍，取0.5 ml稀釋液加入4.5 ml 2溶液，沸水浴14 min，流水冷卻。以未接種發酵液為空白，在608 nm處測吸光值，根據標準曲線計算發酵液中1含量。

2.4 甘油濃度測定

用高碘酸氧化法[8]測發酵液中甘油的含量。

2.5 測定條件研究

2.5.1 測定波長的選擇

按2.2方法以蒸餾水為空白參比掃描不同1濃度400～700 nm的吸收光譜。每個樣品三次重復。

是保持同樣的的2溶液濃度，僅改變1濃度得到的一系列吸收光譜。從圖2中可以看出，在608 nm波長處顯色反應有zui大吸收值，且吸光度的增加與1溶液濃度的增加成正比。盡管在405 nm波長處顯色反應也有吸收峰，但峰值較低，因而本法zui終選擇測定波長為608 nm (OD608)。

圖2不同1濃度吸收光譜

2.5.2 顯色劑用量的選擇

取0.2 g/l 1溶液0.5 ml，分別加入含不同濃度的2溶液，顯色反應后流水冷卻，測定吸光度OD608。由圖3A得出結論，2含量高于1%（w/v）時吸光值不再增加，用量過少導致1與其不能充分反應，所測結果比實際偏低，故本法zui終選擇的顯色劑用量為1%（w/v）

 A不同濃度2對吸光值的影響；  B不同濃度濃硫酸含量對吸光值的影響；

C不同溫度對吸光度的影響；    D反應時間對吸光值的影響

2.5.3 硫酸用量的確定

在酸性條件下1才能與2結合，生成藍色的復合物。由圖3B得出結論，濃硫酸含量為10%時生成的藍色復合物吸光值達到zui大。濃硫酸加入量不足或過多均導致吸光值偏低，且硫酸加入量過多會使反應冷卻后吸光值不穩定。

2.5.4 加熱溫度的選擇

常溫下2與1反應很慢，3C表明，在沸水浴條件下，生成的復合物吸光值zui大，用冷水冷卻后吸光值穩定。

2.5.5 加熱時間的選擇

沸水浴條件下反應需一定的時間1才能與2充分反應，3D表明，沸水浴14 min后，吸光值zui大，且吸光值穩定，有利于準確測定；隨著加熱時間的增加，吸光值略有降低，冷卻后吸光值不穩定。因而，本法選用的沸水浴時間為14 min。

2.6  測定方法的影響因素

2.6.1   顯色穩定時間的選擇

取不同濃度1溶液與顯色劑反應后，在不同時間測定吸光值，試樣溶液在顯色完成至12 h內吸光值穩定，表明本方法顯色穩定性良好。

2.6.2 相關影響因素研究

取發酵72 h的發酵液與未接種的培養基，8000 g離心10 min。取0.5 ml未接種培養基，以水為空白對照測吸光值，培養基在OD608值為0。結果說明甘油和培養基中的雜質對該測定方法沒有影響。

量取1 ml離心上清液，加入4 ml無水乙醇[9]，搖勻，離心后吸上清加蒸餾水稀釋100倍，測其吸光值。與未加乙醇沉淀蛋白質的發酵液相比，二者吸光值沒有顯著的差別。結果表明菌體自溶產生的可溶性蛋白對該檢測方法影響不大。

2.7  線性范圍及檢測限

按“2.2”項下方法分別配制不同濃度的1溶液進行標準曲線繪制，結果表明1的濃度在0.5 g/l以內時，吸光度（A）與質量濃度（c）呈線性關系。1濃度為0.1～0.4 g/l時，0.2≤ OD608 ≤0.8，回歸方程為A=0.00855+1.9095c (r2=0.999)，線性良好。

2.8 精密度、回收率及準確度實驗

取發酵液待測樣品，按照10 g/l和15 g/l的量精密加入1，按“2.2”項下方法反應后測定1的含量（重復測定五次），結果見表1所示，本方法的平均回收率和RSD均在正常誤差范圍之內。

表1   精密度和回收率測定（n=5）

此外，對樣品還進行了分光光度法和HPLC法測定的對比實驗，以測定該法的準確度。將含有不同濃度1（10~100 g/l）的發酵液稀釋后分別按照“2.2”和“2.3”項中方法分別進行測定。實驗結果表明，兩種方法的測量誤差在2%以內，進一步證明本測定方法不受發酵液中甘油雜質的影響，具有相對較高的準確度。

2.9  發酵液中1濃度變化曲線的測定

按照“2.2”項中的方法，測定發酵液中1濃度變化曲線，并同時測定甘油的濃度變化（方法見“2.4”項），結果如圖4。從圖中可以看出，隨著發酵時間延長，底物甘油呈下降趨勢，在微生物分泌的酶作用下被轉化成產物1，108 h時1產量達到64.5 g/l，轉化率達到79.6%（1/甘油，w/w）。

  甘油轉化生成1曲線

3. 討論

本文建立了用2分光光度法測定甘油為底物的發酵液中1含量的方法。測定*波長選為608 nm，2*濃度為1%（w/v）；沸水浴加熱時間14 min。該方法測定過程不受發酵液中甘油和可溶性蛋白影響，具有顯色穩定、測量快速準確的優點，非常適合于微生物發酵法生產1工藝中的產物測定。

結論：甘油為底物發酵液中二羥基丙酮的分光光度檢測方法。考察顯色劑的用量、反應溫度、反應時間、顯色穩定時間、發酵液成分和發酵液中菌體自溶物等對測定的影響。該方法的相關系數R2=0.999，檢測范圍0.1～0.4 g/l，樣品回收率達102.4%，測定結果不受發酵液中甘油及其它雜質影響，具有快速準確的優點。